第10节

性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。

（二）分子杂交分析 分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下： PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。 PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。 四、PCR技术在HIV检测中的应用 PCR可用来追踪HIV的自然感染史。

可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长潜伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。 （一）血清抗体阳性病人HIV序列的检测 有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物，精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。 从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。

通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100%检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64%，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的异源性，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99%）。 (二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测 由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月.对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24～39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。

(三)新生儿HIV序列的检测 HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%～60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30～50%的这些新生儿可在母亲的子宫里,在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何症状.病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药毒性大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12～15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的. PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。

最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。 二、 艾滋病诊断标准： 1．艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。 （1）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续发热达38℃一个月以上； （2）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续腹泻（每日达3-5次）一个月以上。 （3）卡氏肺囊虫肺炎（PCR） （4）卡波济肉瘤KS。 （5）明显的霉菌或其他条件致病感染。 2．若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时，可为实验确诊艾滋病病人。 （1）CD4/CD8（辅助/抑制）淋巴细胞计数比值<1，CD4细胞计数下降； （2）全身淋巴结肿大； （3）明显的中枢神经系统占位性病变的症状和体征，出现痴呆，辩别能力丧失，或运动神经功能障碍。 鉴别诊断 需与下列疾病进行鉴别： 一、原发性免疫缺陷病。 二、继发性免疫缺陷病，皮质激素，化疗，放疗后引起或恶性肿瘤等继发免疫疾病。

三、特发性CD4+T淋巴细胞减少症，酷似AIDS，但无HIV感染。 四、自身免疫性疾病：结缔组织病，血液病等，AIDS有发热、消瘦则需与上述疾病鉴别。 五、淋巴结肿大疾病：如KS，何杰金病，淋巴瘤，血液病。 六、假性艾滋病综合征：AIDS恐怖症，英国同性恋中见到一些与艾滋病早期症状类似的神经症状群。 七、中枢神经系统疾病：脑损害可以是艾滋病或其他原因引起的，需予鉴别。

艾滋病临床表现 HIV感染的临床表现分无症状的潜伏和严重的机会感染及肿瘤的临床症状。 一、 无症状的潜伏期 从感染HIV2-12周后，多者6-8周，抗HIV抗体转为阳性，此时少数人呈现一过性急性感染症状，包括发热、皮疹、僵直、淋巴结肿大、关节痛、肌痛、斑丘疹、荨麻疹、腹痛、腹泄及个别病人出现无菌性脑膜炎，查白细胞正常，但单核细胞增多，淋巴细胞比例轻度降低，血小板轻度减少。其后持续呈无症状期，待细胞免疫功能低下时开始发病，无症状期可持续2-5年也有超过15年以上，大多数成人和青年感染HIV后，可长时间没有症状，但可检出病毒复制。随着免疫系统损伤，病毒不断增多，大多数感染了HIV的人才出现相关症状，如开始时出现倦怠感，发热持续不退，食欲不振和原因不明的体重减轻，继而出现腹泻、盗汗、淋巴结肿胀（首先腋下、股部等）全身症状。当HIV侵犯中枢神经系统时，常出现痴呆、健忘等症状。如果仅具有病毒抗体，而没有AIDS的特有的机会感染等症状时，称AIDS相关征候群（AIDS-relatedcomplex ，ARC）以及持续性全身淋巴结病（PGL）。

HIV感染后经过2-5年最终发展成AIDS者具有10%左右，ARC30%左右，而无症状的HIV携带者占60%左右，从ARC发展成AIDS者占15%左右，所以大量患者为无症状的携带者。这就给AIDS的预防带来极大的困难。 HIV感染分类及AIDS诊断标准。 美国1993年修订的HIV感染分类系统及在青少年和成人中扩增监测艾滋病病例的诊断标准见表1 表1 美国1993年修订的HIV感染分类系统及AIDS诊断标准

CD+4T淋巴细胞分类 临床分类

（A） （B） （C）

无症状的，急性（初期）HIV或持续的全身性淋巴结肿大 有症状，但无A或C的情况 有艾滋病指征

①≥500/μl A1 B1 C1

②200～499/μl A2 B2 C2

③＜200μl（T细胞计数中的艾滋病指征） A3 B3 C3 该标准是根据HIV感染者的临床表现分成A、B、C三种，又用CD4+T淋巴细胞计数将每个临床类型分成三个等级，在上述3种临床分类中，除分类C全部属艾滋病例外，凡CD4+T淋巴细胞<200/μl，或CD4+T淋巴细胞百分比<14%的HIV感染者（即A3，B3），也可归入艾滋病病例。 美国CDC1993年HIV感染分类系统和艾滋病诊断标准说明，见表2 表2 美国CDC1993年HIV感染分类系统和艾滋病诊断标准说明表

分类 （下述分类有前提，必须是HIV感染者）。 详细内容

分类A：凡是有下列三种情况之一者，即可归入A类：

1.无症状的HIV感染者； 2.持续的全身性淋巴结肿大； 3.有急性（初期）HIV感染的疾病或病史者；

分类B 有下列11种情况之一者，归入B类 1.杆菌引起的血管瘤病； 2.口咽部的念珠菌病（鹅口疮）； 3.持续、经常或治疗反应差的外阴阴道念珠菌病； 4.宫颈发育异常（轻度/严重）/宫颈原位癌； 5.持续一个月以上的全身性症状，如发热（38.5℃）或腹泻。 6.口腔有毛状粘膜白斑病； 7.包括至少二次明显的突发或一处以上皮区的带状疱疹； 8.特发的血小板减少性紫癜； 9.李司忒菌病； 10. 盆腔炎症状性疾病，特别是并发输卵管、卵巢脓肿； 11. 周围神经病。