第9节

人才 会感染。而另一些地方，性病被认为是荣誉和性征服的象征。 如何才能鼓励男性在需要的时候去使用卫生服务或寻求支持呢？当在健康中 心询问男性的需求时，男性通常提出与女性相同的要求：在可接受的价格范围内 获得高质量的服务，隐私，保密，卫生服务人员关心男性的需求，包括男性同性 性行为者；及提供临床服务的时间能错开他们的工作时间。一些男性首选男性医 生和护士。在一些像澳大利亚这样的国家，公共卫生部门通常有一些创新性的措 施，如开男性夜诊，鼓励男性不仅仅寻求艾滋病相关的咨询与检测，也要筛查和 治疗前列腺和睾丸癌。一些在社区的组织已经开始支持帮助在儿童时期受到性虐 待的男性群体。 组织包括艾滋病病毒感染者在内的面对压力的男性开展讨论也是有效的方法。

1996年，乌干达一个称作TASO的艾滋病支持组织成立了一个艾滋病病毒感染男性 协会来帮助感染艾滋病病毒的男性。在男性希望讨论失业与贫穷等更广泛话题的 同时，他们的参与也使他们更多地去寻求医疗服务并更好地与妻子交流。 男性与家庭 男性不愿承认有健康问题和不愿寻求帮助的态度在艾滋病问题上也是一样。 来自非洲、亚洲及其它地区的报告显示感染艾滋病病毒的男性比女性更不情愿相 互支持和寻求家庭及朋友的帮助。发现自己艾滋病病毒感染的男性通常比女性更 难处理这仪问题。一个例外是在男性同性性行为的艾滋病病毒感染者中有一个存 在于男性同性性行为感染者之间的支持网络。 但当感染艾滋病病毒的男性开始患病时，他们是最可能受到家庭关怀。在传 统的男女分工中，护理患病家庭成员的担子通常落到女性身上。尽管艾滋病病毒 通过婚内性传播可以感染夫妻双方且双方都需要得到护理，但这种男女分工的模 式在艾滋病时代仍然盛行。来自多米尼加共和国和墨西哥的研究显示患艾滋病的 已婚女性通常回到自己父母家中，因为他们不太可能受到丈夫的充分的护理。非 洲的一些研究显示家庭更倾向于为患艾滋病男性成员寻求并支付医疗服务。

全世界的研究也显示，与女性相比男性通常更少照顾孩子，这部分是因为男 性有更大的可能性在家庭之外工作，同时另一部分原因是没有鼓励和培养男性成 为关护的提供者。这同样促进了艾滋病的流行，到2000年底将留下1300万需要成 人帮助提供衣服、住房和教育的孤儿。尽管一些孤儿群体或家庭由男孩领头，但 他们中大多数由女性亲人或邻居来照顾。 但男性作为丈夫在家中是主要经济支柱，在家庭中作为父亲而受到尊重。一 系列的努力成功地促使父亲和未来的父亲承担其照顾孩子的责任（如在巴西，喀 迈隆，牙买加，瑞典，乌干达）。这许多措施已经促使男性对其子女和需要关怀 的亲人作出了更多的承诺。因此急需将这些措施扩大到更广的范围，特别是在世 界上艾滋病严重流行的地区。 父亲及需生育子女的男性需要更清醒地认识到他们有可能将艾滋病病毒传播 给性伴，并因此通过母婴传播传给其子女。他们必须牢记在自己和妻子死于艾滋 病后，其子女将沦为孤儿。如何才能促使父亲为了其子女的原因而采取安全行为 保护自己不受艾滋病病毒的感染呢？或者如果他们已经怀疑或知道自己感染了艾 滋病病毒如何才能促使他们去保护自己的妻子和子女免受感染呢？

一个可能的方 法就是使父亲更多地关注子女的生活。重要的是当不能将男性对性行为态度方面 的有关复杂因素简单化时，强调父亲角色的重要性是鼓励男人对其性行为后果进 行慎重考虑的一种方法。 预防艾滋病男人责无旁贷 尽管目前男性的行为大大促进了艾滋病的传播和影响，并使自己处于危险的 前沿，但这样的行为是可以变化的。 鼓励男性作为艾滋病防治工作的参与者是改变艾滋病流行进程的根本方法。 对男性进行指责不可能促使男性倾听并改变他们的行为方式。 通过世界艾滋病运动，联合国艾滋病规划署及其全球的伙伴将与男性和女性， 非政府组织、政府和联合国系统一起共同努力针对男性开展新的、迫切需要的工 作。 行动要点 性别意识 对性别角色传统认识和期望会影响男性和女性，对此要增进理解并支持那些 增进男女平等的工作。 对那些有害的关于男性力量和其它角色方面的认识要提出挑战。 鼓励对男孩的培养和对男性行为的期望等进行讨论。 性交流和协商 鼓励男性之间及与其性伴就性、吸毒和艾滋病话题进行交谈。 增进女性决定性行为何时，何地及是否发生的能力。 增加男性获得适当的信息、咨询和支持的能力.促进对男性同性性行为者的 理解和认同。

暴力和性暴力 支持政府和非政府组织采取行动减少男性暴力和性暴力。 支持和关怀 帮助男性无论在家庭中还是在社会上要承担起父亲、关怀与支持提供者的角 色。 预防艾滋病，男人责无旁贷 尽管目前男性的行为大大促进了艾滋病的传播和影响，并使自己处于危险的 前沿，但这样的行为是可以变化的。 鼓励男性作为艾滋病防治工作的参与者是改变艾滋病流行进程的根本方法。 对男性进行指责不可能促使男性倾听并改变他们的行为方式。 通过世界艾滋病运动，联合国艾滋病规划署及其全球的合作伙伴将与男性和 女性，非政府组织、政府和联合国系统一起共同努力针对男性开展新的、急需的 工作。

艾滋病诊断及鉴别诊断 一、 诊断依据： （一） 流行病学及临床表现 （二） 实验室检查 （1） 主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显著减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人为1.25～2.1），迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。 （2） B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。 （3） NK细胞活性下降 （4）各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS； （三）HIV抗体检测 1.酶联免疫吸附法（ELISA）；2.明胶颗粒凝集试验（PA）；3.免疫荧光检测法（IFA）；4.免疫印迹检测法（WesternBlot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。 （四）PCR技术检测HIV病毒 1．标本的采集与模板核酸的制备。

从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。 可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）： ① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。 ② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。 ③ 2500r/min离心20min。 ④吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。 ⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使细胞浓度为2×106/ml。 ⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。 2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。

（1）从外周血单核细胞中提取DNA 方法A： ① 取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。 ② 加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。 ③ 2500r/min离心10min，弃上清。 ④ 沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。 ⑤ 加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/LMgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。 ⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。 该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。 方法B： ① 取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。 ② 2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。 ③ 用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。 ④ 再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。

⑤ 通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。 ⑥ 将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris-HClpH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。 ⑦用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。 ⑧ 加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。 该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。 （2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录 方法A： ① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。 ② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。 ③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。 ④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。

⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。 ⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。 在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。 ⑦ 取10μlRNA样品加2.7U DNase I。 ⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。 ⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNaseA（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。 方法B： ① 取5ml新鲜血浆置一支离心管内。 ② 40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。

③ 将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇）中充分混匀. ④ 加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min. ⑤ 13000r/min离心20min. ⑥ 轻轻将水相转移到一支新管中. ⑦ 加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右. ⑧ 13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀. ⑨ 沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥. ⑩ 加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录. ⑾ 取10μl RNA样品. ⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/LTris - HCl，pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GNGHD QLP GX PUH R XHH TR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。

⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min. ⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。 由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。 三、PCR扩增步骤 （一）引物的设计与合成 HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。 检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。 已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。

通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。 表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针

引物 及探针 序列（5′3′） 基因 区 片段（bp）

SK38 ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT gag 115(HIV1)

SK39 TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC

SK19(P) ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC

SK145 AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT gag 141(HIV1)

SK101 GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC

139(HIV2)

SK102(P) GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT

SK145 AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT gag 142(HIV1)

SK150 TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC

139(HIV2)

SK102(P) GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT

O-1 GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC gag 525(HIV1)